It-teknoloġija tal-PCR għandu jkollha primers raġonevoli sintetizzati artifiċjalment u estratt DNA tal-kampjun, u mbagħad twettaq ċikliżmu termali awtomatiku, u finalment twettaq identifikazzjoni u analiżi tal-prodott. Fil-preżent, id-disinn u s-sinteżi tal-primer jistgħu jitwettqu biss fi ftit istituti ta 'riċerka, istituti u kliniki b'saħħa teknika qawwija. L-applikazzjoni teħtieġ biss tixtri l-kit ta 'detezzjoni tal-PCR biex tibda x-xogħol. Hemm ħafna fatturi li jinfluwenzaw fiċ-ċiklu termali awtomatiku tal-PCR. Għal kampjuni tad-DNA differenti, l-ammont ta 'komponenti varji miżjuda fir-reazzjoni tal-PCR u l-parametri taċ-ċiklu tat-temperatura huma inkonsistenti.
Diversi fatturi ewlenin li jinfluwenzaw issa huma introdotti kif ġej.
Wieħed, parametri taċ-ċiklu tat-temperatura
Fiċ-ċiklu termali awtomatiku tal-PCR, l-aktar fattur kritiku huwa t-temperatura tad-denaturazzjoni u l-ittemprar. Kif muri fl-eżempju ta 'operazzjoni, il-kundizzjonijiet ta' denaturazzjoni, ittemprar u estensjoni huma: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, total ta '25 ~ 30 A ċiklu, il-framment amplifikat huwa 500bp. Hawnhekk, il-ħin ta 'kull pass għandu jiġi kkalkulat wara li t-taħlita ta' reazzjoni tilħaq it-temperatura meħtieġa. Fil-ċiklatur termali awtomatiku, il-ħin mit-temperatura oriġinali tat-taħlita għat-temperatura meħtieġa jieħu 30-60s It-tul ta 'dan il-ħin ta' dewmien jiddependi fuq diversi fatturi, inkluż it-tip ta 'tubu ta' reazzjoni, ħxuna tal-ħajt, volum ta 'taħlita ta' reazzjoni, sħana sors (banju ta 'l-ilma jew blokk ta' tisħin), u d-differenza fit-temperatura bejn iż-żewġ passi, li għandha tkun ipprovduta b'mod adegwat meta tissettja ċ-ċiklu termali Oqgħod attent u tikkunsidra, u l-kejl attwali għandu jitwettaq fuq kull strument.
Konsiderazzjoni importanti oħra dwar il-ħin taċ-ċiklu termali hija d-distanza bejn iż-żewġ primers; iktar ma tkun 'il bogħod id-distanza, iktar ikun hemm bżonn biex jiġi sintetizzat it-tul sħiħ tas-sekwenza fil-mira. Il-ħin ta 'reazzjoni mogħti hawn fuq huwa bbażat fuq l-aħjar tul ta' sinteżi ta '500bp Is-sekwenza fil-mira hija mfassla. Hawnhekk hawn introduzzjoni għall-għażla ta 'temperaturi varji.
1. Template temperatura tad-denaturazzjoni It-temperatura tad-denaturazzjoni tiddetermina t-temperatura li fiha d-DNA double-stranded jiddewweb fir-reazzjoni tal-PCR. Jekk it-temperatura tad-denaturazzjoni ma tintlaħaqx, l-ebda mudell tad-DNA single-stranded ma jiġi prodott, u l-PCR mhux se jibda. Temperatura baxxa ta 'denaturazzjoni tfisser denaturazzjoni mhux kompluta, DNA double-stranded Se terġa' tinnatura malajr, u b'hekk tnaqqas ir-rendiment. Ġeneralment 90~95℃. Ladarba l-kampjun jilħaq din it-temperatura, għandu jitkessaħ malajr għat-temperatura ta 'l-ittemprar. Id-denaturazzjoni tad-DNA tieħu biss ftit sekondi, u mhix meħtieġa għal żmien twil; għall-kuntrarju, għandek tipprova l-almu tiegħek f'temperatura għolja. Qassarha biex iżżomm l-attività ta' Taq DNA polymerase. It-temperatura massima tad-denaturazzjoni wara li żżid Taq DNA polymerase m'għandhiex taqbeż 95°C.
2. Temperatura tal-ittemprar tal-primer It-temperatura tal-ittemprar tiddetermina l-ispeċifiċità u r-rendiment tal-PCR; jekk it-temperatura hija għolja, l-ispeċifiċità hija b'saħħitha, imma jekk it-temperatura tkun għolja wisq, il-primer ma jistax jiġi kkombinat sew mal-mudell, u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tad-DNA titnaqqas; it-temperatura hija baxxa, ir-rendiment huwa għoli, iżda baxx wisq jista 'jikkawża nuqqas ta' tqabbil tal-primer u l-mudell, Żieda ta 'prodotti mhux speċifiċi. Ġeneralment, ibda bil-kundizzjoni ta 'reazzjoni ta' 37 ℃, waqqaf serje ta 'reazzjonijiet ta' kontroll biex tiddetermina l-aħjar temperatura ta 'ttemprar għal reazzjoni speċifika. Jista 'jiġi dedott ukoll abbażi tal-kontenut (G+C)% tal-primers biex taqbad it-test Il-punt tal-bidu tat-test ġenerali, it-temperatura tal-ittemprar Ta (temperatura tal-ittemprar) hija 5℃ aktar baxxa mit-temperatura tat-tidwib TTm (temperatura tat-tidwib) tal-primer ta 'amplifikazzjoni, li jista' jiġi kkalkulat skond il-formula:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Fosthom, A, T, G, u C rispettivament jirrappreżentaw in-numru ta 'bażijiet korrispondenti. Pereżempju, għal primer ta '20 bażi, jekk il-kontenut ta' (G+C)% huwa 50%, il-punt tal-bidu ta 'Ta jista' jiġi ssettjat f'55 °C. F'konċentrazzjoni ta 'primer tipika (bħal 0.2μmol/L), ir-reazzjoni ta' ttemprar tista 'titlesta fi ftit sekondi, u l-ittemprar fit-tul mhuwiex meħtieġ.
3. L-għażla tat-temperatura tal-estensjoni tal-primer tiddependi fuq l-aħjar temperatura ta 'Taq DNA polymerase. Ġeneralment 70 ~ 75 ℃, ir-rata standard ta 'nukleotidi katalizzati b'enzimi f'72 ℃ tista' tilħaq 35 ~ 100 nukleotidi / sek. kull minuta. It-tul ta '1kb jista' jiġi estiż, u l-veloċità tiegħu tiddependi fuq il-kompożizzjoni tas-soluzzjoni buffer, il-valur tal-pH, il-konċentrazzjoni tal-melħ u n-natura tal-mudell tad-DNA. Jekk il-framment amplifikat huwa iqsar minn 150bp, il-pass ta 'estensjoni jista' jitħalla barra, u jsir ċiklu ta 'temperatura doppja, minħabba Taq DNA Il-polimerażi hija biżżejjed biex tlesti s-sintesi ta' sekwenzi qosra fit-temperatura ta 'l-ittemprar. Għal frammenti ta 'sekwenza qasira bejn 100 u 300 bp, huwa effettiv li jintuża ċiklu ta' temperatura doppja veloċi u sempliċi. F'dan iż-żmien, it-temperatura tal-estensjoni tal-primer hija l-istess bħat-temperatura tal-ittemprar. Għal Għal frammenti tad-DNA 'l fuq minn 1kb, il-ħin ta' estensjoni jista 'jiġi kkontrollat fi żmien 1 sa 7 minuti skond it-tul tal-framment. Fl-istess ħin, ġelatina jew reaġent BSA għandhom jiġu miżjuda mal-buffer tal-PCR biex iżżomm it-Taq DNA polymerase attiva u stabbli għal żmien twil. Sess; 15% -20% gliċerol jgħin biex jamplifika madwar 2.5kb jew frammenti itwal tad-DNA.
4. In-numru ta 'ċikli ta' PCR konvenzjonali huwa ġeneralment 25 sa 40 ċiklu. L-iżball ġenerali huwa li n-numru ta 'ċikli huwa wisq, l-isfond mhux speċifiku huwa serju, u l-kumplessità tiżdied. Naturalment, in-numru ta 'ċikli tar-reazzjoni huwa żgħir wisq, u r-rendiment huwa baxx. Għalhekk, huwa meħtieġ li jiġi żgurat li l-prodott jinkiseb. Taħt il-premessa tar-rata, in-numru ta 'ċikli għandu jiġi minimizzat.
Wara li titlesta l-amplifikazzjoni, il-kampjun jitkessaħ u jinħażen f'4°C.
2. Primer Primer Disinn
Biex tkabbar id-DNA tal-mudell, l-ewwel trid tiddisinja żewġ primers oligonucleotide. L-hekk imsejħa primers huma fil-fatt żewġ frammenti oligonukleotidi li huma komplementari għas-sekwenza tad-DNA fil-mira li għandha tiġi amplifikata. Id-distanza bejn iż-żewġ primers tiddetermina t-tul tal-framment amplifikat. , Il-5'truf taż-żewġ primers jiddeterminaw il-pożizzjonijiet taż-żewġ 5'truf tal-prodott amplifikat. Wieħed jista 'jara li l-primers huma ċ-ċavetta biex jiddeterminaw it-tul, il-pożizzjoni u r-riżultati tal-frammenti amplifikati tal-PCR, u d-disinn tal-primer huwa aktar importanti.
Il-kundizzjoni meħtieġa għad-disinn tal-primer hija li s-sekwenza tad-DNA fil-mira kumplimentari għall-primer trid tkun magħrufa. Is-sekwenza bejn iż-żewġ primers mhix neċessarjament ċara. Iż-żewġ sekwenzi magħrufa huma ġeneralment 15-20 bażi, li jistgħu jiġu sintetizzati b'sintetizzatur tad-DNA. Li jikkorrispondu għal żewġ primers komplementari, barra minn hekk, il-prinċipji ġeneralment segwiti fid-disinn tal-primer jinkludu:
1. It-tul tal-primer huwa kkalkulat skont l-istatistika, u l-probabbiltà li sekwenza oligonukleotide ta 'madwar 17-il bażi tista' tidher fil-ġenoma tal-bniedem hija darba. Għalhekk, it-tul tal-primer huwa ġeneralment mhux inqas minn 16-il nukleotide, u l-ogħla Mhux aktar minn 30 nukleotide, u l-aħjar tul huwa 20-24 nukleotide. Tali oligonukleotidi qosra mhux se jiffurmaw ibridu stabbli fit-temperatura tal-polimerizzazzjoni (li jgħaddi minn 72 ° C). Xi drabi jista 'jkun f'5' Żid sekwenzi li mhumiex komplementari għall-mudell fl-aħħar, bħal siti jew promoturi ta 'enżimi ta' restrizzjoni, biex tlesti l-klonazzjoni tal-ġeni u bżonnijiet speċjali oħra; il-primer 5'tarf it-tikketta tal-bijotina jew it-tikketta fluworexxenti jistgħu jintużaw għal skopijiet varji bħal skoperta mikrobjali.
Xi drabi l-primer ma'ma jaħdimx, ir-raġuni mhix magħrufa, tista 'timxi l-pożizzjoni biex issolviha.
2. Il-kompożizzjoni ta 'primers tal-kontenut (G+C)% għandha tkun uniformi, u tipprova tevita li jkun fiha l-istess polimeru bażi. Il-kontenut (G+C)% fiż-żewġ primers għandu jkun simili kemm jista' jkun, fil-framment amplifikat magħruf (G{+C) % Il-kontenut għandu jkun qrib il-framment li jrid jiġi amplifikat, ġeneralment 40% sa 60% huwa aħjar.
3. In-naħa ta 'ġewwa tal-primer għandha tevita l-formazzjoni ta' strutturi sekondarji ovvji, speċjalment strutturi hairpin. Pereżempju:
4. M'għandu jkun hemm l-ebda kumplimentazzjoni bejn iż-żewġ primers bejn il-primers, speċjalment fit-3'tarf tal-primer. Anke jekk ma jistax jiġi evitat, il-3'tarf bażi komplementari m'għandux ikun akbar minn 2 bażijiet, inkella huwa faċli li tifforma"primer dimer" Jew"Primer dimer" (Primer dimer). L-hekk imsejjaħ dimer primer huwa essenzjalment framment tad-DNA bi stranded doppju ffurmat bl-estensjoni ta 'primer wieħed fuq is-sekwenza primer l-oħra taħt l-azzjoni tad-DNA polymerase. , Huwa prodott sekondarju komuni tal-PCR, u xi kultant anke jsir il-prodott ewlieni.
Barra minn hekk, evita sekwenzi omoloġi bejn iż-żewġ primers, speċjalment frammenti ta 'oligonucleotide b'aktar minn 6 bażijiet identiċi konsekuttivi, inkella ż-żewġ primers jikkompetu ma' xulxin għall-istess sit tal-mudell; bl-istess mod, il-primers u d-DNA fil-mira li jridu jiġu amplifikati Jew sekwenzi oħra tad-DNA tal-kampjun ma jistgħux ikollhom sekwenzi omoloġi ta' aktar minn 6 bażijiet. Inkella, il-primers se jorbtu ma 'siti oħra, inaqqsu l-amplifikazzjoni speċifika u jżidu l-amplifikazzjoni mhux speċifika.
5. Primer 3'end pairing DNA polymerase żżid nukleotide wieħed mat-3'tarf tal-primer. Għalhekk, ir-rekwiżiti ta 'tqabbil ta' bażijiet 5-6 mit-tarf 3'tal-primer u d-DNA fil-mira għandhom ikunu preċiżi u stretti biex jiżguraw amplifikazzjoni effettiva tal-PCR. .
Jekk id-disinn tal-primer huwiex raġonevoli jista 'jiġi vverifikat permezz ta' tfittxija tal-kompjuter bl-użu ta 'softwer PCRDESN u softwer Amerikan PRIMER.
Oligonukleotidi sintetizzati artifiċjalment għandhom preferibbilment jiġu ppurifikati bil-kromatografija (kromatografija) jew PAGE biex jitneħħew impuritajiet bħal ktajjen qosra li ma ġewx sintetizzati sa tul sħiħ. Primers purifikati maħżuna f'soluzzjoni ta '25% acetonitrile f'4 °C jistgħu jipprevjenu mikro-organiżmi Taħt ċirkostanzi normali, primers mhux użati għandhom jinħażnu fi friġġ f'-20 °C. Il-primers jistgħu jinħażnu f'likwidu għal 6 xhur, u jistgħu jinħażnu għal 1 sa 2 snin wara lajofilizzazzjoni.